BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞的NF-κB信号通路激活 1.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞NF-κB亚基p65磷酸化 在对照细胞未见p65亚基磷酸化,而TNF-α (25ng/ml)处理细胞30mmin能诱导NF-κB P65亚基磷酸化显著增加。BJA3121以10,20,30和40μg/ml预处理A549细胞1h,能剂量依赖性抑制TNF-α诱导的A549细胞p65亚基的磷酸化。 2、BJA3121抑制TNF-α诱导的NF-κB p65从胞浆向细胞核转运 与对照细胞比较,25ng/ml剂量TNF-α处理1h诱导细胞胞核NF-κB p65含量明显增加；BJA3121以10,20,30和40μg/ml预处理A549细胞1h后,显著抑制TNF-α引起的胞核NF-κB 还有 p65含量的增加,作用有剂量依赖性,但并不影响核内Histone H3蛋白的含量,说明BJA3121抑制NF-κ B p65由胞浆向胞核的转运。然后,我们进一步用细胞免疫方法证明BJA3121抑制TNF-α诱导的NF-κ

B p65由胞浆向细胞核的转运。首先,我们采用免疫荧光技术,应用荧光显微镜直接观察TNF-α诱导的NF-κ B p65核转录与TNF-α诱导时间的关系。与对照组比较,TNF-α处理A549细胞1-4h均可观察到胞核红色荧光随时间增强,以处理1h的时荧光强度增加最明显,说明此时的核转录现象最为明显,表明TNF-α增加NF-κ B p65由胞浆向细胞核的转运。而BJA3121在10,20,30和40μg/ml的剂量预处理细胞2小时明显减少NF-κ B p65由胞浆向细胞核的转运。 3、BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞胞浆I-K B的降解 与无药物和TNF-α处理的对照细胞比较,25ng/ml剂量TNF-α处理30min明显减少了A549肺痛细胞胞浆I-K B的水平；BJA3121以10,20,30和40μg/ml预处理A549细胞1h后以及TNF-α刺激30min后,与TNF-α组比较,细胞胞浆I-K B的量明显增加,表明BJA3121能明显抑制胞浆I-K BYL719溶解度 B降解。 六、BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞P38MAPK信号通路的激活 MAPK是细胞浆内的丝氨酸蛋白激酶,由p38MAPK,细胞外信号调节激酶1 /2MAPK (ERK1/2MAPK)和C–Jun氨基末端激酶MAPK (JNK MAPK)三条信号通路来介导信号转导,其主要功能是参与细胞生长、发育、增殖、分化和死亡等生命功能的调控。当细胞受到刺激时,通过特定的信号通路激活MAPK蛋白激酶,活化后的蛋白激酶转移至核内激活相应的基因受体,进而促进相应基因的表达。我们采用Western

blot方法,研究了BJA3121对TNF-α诱导的A549细胞的P38MAPK, ERK1/2MAPK和JNK MAPK三条信号通路的影响。结果发现,与对照组相比,TNF-α (25ng/ml)处理细胞30min后,能诱导肺癌细胞磷酸化p38(p-p38),磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白明显增加,而对细胞p38, ERK1/2和JNK蛋白表达没有明显影响。BJA3121以10,20,30和40μg/ml预处理A549细胞1h后,TNF-α再处理30min,能明显抑制p-p38MAPK的表达,作用有剂量依赖性,说明BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞P38MAPK的磷酸化。但是BJA311对TNF-α诱导的ERK1/2和JNK

MAPK激活没有明显影响。七.多酚类化合物BJA3121对蛋白激酶活性的影响 蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一类依赖Ca2＋和磷脂的蛋白激酶,在细胞跨膜信号转导的过程中发挥重要的作用。PKC通过催化蛋白质分子中丝氨酸/苏氨酸磷酸化(Ser/Thr磷酸化)来调控细胞的生长,分化,增殖和代谢。我们采用美国KINOMEscanTM公司的高通量筛选技术,对92种蛋白激酶的活性进行了筛选。我们发现,多酚化合物BJA3121在1μM剂量下,对激酶活性抑制率达到25%以上的激酶有18种。其中,对蛋白激酶Cε(PKCε,PRKCE)的抑制活性最强,达到70%。对其他17种激酶的抑制活性依次为：CSNK1D为62%；MAPKAPK2为48%；URKB为48％;JAK3为45.0％;ERBB2为45.0％;ZAP70为42.0％;GSK3B为40.0%；CDK2为39.0％;PIK3CG为37.0％;INSR为35.0%；FAK为32.0％;AURKA为31.0％;SRPK3为29.0%；KIT为28.0%；JAK2为27.0％;IKK-beta为26.0％;A 获悉更多 CDK11为26.0%。 八.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞PKCε蛋白的磷酸化 体外激酶筛选的结果表明,BJA3121对PKCε激酶具有高选择性结合作用。为了进一步证明在TNF-α诱导的A549细胞粘附的炎症模型上,多酚化合物BJA3121也能呈现对PKCε的抑制作用,因此,我们采用Western blot方法,研究了该化合物对细胞PKCε蛋白表达及其磷酸化水平的影响。结果显示,在正常状态下,细胞内存在低水平的PKCε蛋白磷酸化；而TNF-α(25ng/ml)分别处理细胞30mmin,1h和2h后,PKCε蛋白磷酸化水平随着TNF-α处理时间的延长而增加,说明TNF-α能诱导PKCε蛋白的磷酸化。当BJA3121以10,20,30和40μg/ml和TNF-α一起预处理A549细胞30min后,未观察到药物对PKC￡蛋白磷酸化的抑制；但将BJA3121预处理的时间延长至2h后,再将和TNF-α共同作用的时间也延长至2h,结果显示,与TNF-α组相比,剂量为20,30和40μg/ml的BJA3121能明显抑制PKCε激酶蛋白磷酸化,有剂量依赖性。基于上述实验结果和文献分析,本文的结论如下： 1.多酚化合物BJA3121在体外抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人单核白血病THP-1细胞与人肺癌A549细胞粘附。 2.多酚化合物BJA3121在产生粘附作用的剂量下对A549细胞无细胞毒性,排除了药物的抗粘附作用与药物的细胞毒性有关系。 3.多酚化合物BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞的细胞因子IL-8和IL-6以及粘附因子MCP-1基因的表达,但对ICAM-1和MMP-9基因的表达无影响。 4.