7加入细胞因子IL-4和GM-CSF联合刺激的方法,取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养培养3天,在相差显微镜下观察细胞形态,并收集细胞约1-2×104个加CD86、CDllc、CD80及VEGFR1抗体以流式细胞学技术检测细胞表面表达CD86、CDllc、CD80的情况。 2取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养培养3天,收集细胞及细胞培养上清,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术、ELISA技术检测细胞VEGF mRNA、VEGFR1mRNA及蛋白、sVEGFR1表达,流式细胞学技术检测细胞表面VEGFR1蛋白表达。 3取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,细胞培养液分别加入IL-4(10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或GM-CSF(10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml),并设空白组(仅有RAW264.7细胞,无任何细胞因子),在37℃含5%CO2常氧状态下孵育箱中培养3天,收集细胞及细胞培养上清,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术、ELISA技术检测细胞VEGF mRNA、VEGFR1mRNA及蛋白、sVEGFRl表达。
第二部分： 1取两组RAW264.7细胞分别以IL-420ng/ml或GM-CSF20ng/ml浓度加入培养液,在37℃常氧、含5%CO2条件下孵育15min,30min,1h,收集细胞,提取蛋白,以western blot技术检测细胞中P38磷酸化表达,以检验在细胞因子的刺激下细胞中是否有P38信号通路的激活。 哪里 2取SB203580(1：1000)加入细胞培养液,将RAW264.7细胞在孵育箱中培养1h,去除含SB203580的培养液,重新加入按实验要求含不同刺激因子的培养液,在37℃含5%CO2常氧状态下孵育箱培养3天后收集细胞及细胞培养上清,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术、ELISA技术检测细胞VEGF mRNA、VEGFR1mRNA及蛋白、sVEGFRl表达。
第三部分： 1取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和(GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养3天,收集细胞,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术检测细胞Gadd45amRNA、gadd45a蛋白表达。 2取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,细胞培养液分别加入IL-4(10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或GM-CSF(10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml),并设空白组(仅有RAW264.7细胞,无任何细胞因子),在37℃含5%CO2常氧状态下孵育箱中培养3天,收集细胞,提取RNA,以PCR技术检测细胞Gadd45a mRNA表达。 3采用RNA小干扰技术,用Gadd45a-SiRNA转染RAW264.7细胞使Gadd45a基因表达沉默,在要求时间内提取细胞RNA,检测转染效率,并将Gadd45a基因沉默后的RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养,规定时间内收集细胞及培养上清,提取细胞RNA,以PCR技术、ELISA技术检测细胞Gadd45基因表达正常或沉默条件下VEGFR1mRNA, VRT752271购买 sVEGFRl表达。 结果： 1细胞培养3天后相差显微镜下观察：加入细胞刺激因子IL-4和GM-CSF的细胞体积变大,胞核变大,细胞形态呈现多样化,并且伸出长长的伪足,形状类似不成熟树突状细胞(immature
DC)流式细胞学技术检查细胞膜表面共刺激分子CDllc、CD86、CD80表达升高,表示RAW264.7在IL-4和GM-CSF联合刺激下向未成熟DC样细胞发育。 2未成熟DC样细胞较RAW264.7细胞表达高水平的VEGFR1mRNA及VEGFR1蛋白,细胞膜表面VEGFR1蛋白表达无显著差异,sVEGFR1表达显著增高,但是VEGF mRNA表达下调,表明抗血管生成性能增加。 3IL-4能提高RAW264.7细胞中VEGFR1mRNA和VEGFR1蛋白的表达及减少细胞膜表面膜联蛋白VEGFR1表达,上调sVEGFR1水平。GM-CSF没有增加VEGFR1mRNA表达,但提高VEGFR1的蛋白表达,膜联蛋白VEGFR1表达略有增高,sVEGFR1水平增加,增高幅度小于IL-4。两种刺激因子均对VEGF 所以 mRNA表达无明显影响。细胞因子剂量的不同对细胞因子的作用结果无显著差异。 4两种细胞因子作用15min即可看到P38信号通路在RAW264.7细胞内开始激活。SB203580使得未成熟DC样细胞表达VEGFR1mRNA减少,但是sVEGFRl水平升高。SB203580使用后,IL-4和GM-CSF刺激RAW264.7细胞表达VEGFR1mRNA下降,IL-4刺激细胞表达sVEGFRl水平下降,但是GM-CSF却刺激细胞表达sVEGFR1水平略有上升,两种因子刺激后的细胞膜表面膜联蛋白VEGFR1表达较RAW264.7细胞无明显差别。 5未成熟DC样细胞较RAW264.7细胞表达高水平的Gadd45a mRNA及Gadd45a蛋白。 6Gadd45a基因沉默的未成熟DC样细胞较Gadd45a基因表达正常的未成熟DC样细胞表达下调的VEGFR1mRNA及sVEGFR1水平。 结论 1RAW264.7细胞在IL-4和GM-CSF联合刺激下,向未成熟DC样细胞发育的同时伴随着VEGFR1mRNA表达上调及sVEGFR1增高,但VEGF mRNA表达下降显示了在此过程中细胞的抗血管形成功能逐渐上升。 2两种因子对细胞的sVEGFR1上调机制各不相同：IL-4能提高VEGFR1mRNA表达、VEGFR1蛋白的翻译及sVEGFR1水平,同时减少细胞膜上膜联蛋白VEGFR1表达,提示IL-4可能增强TACE活性从而增强其主导的胞外功能域脱落的蛋白水解作用,使得sVEGFR1表达增强。GM-CSF没有增加VEGFR1mRNA表达,但提高VEGFR1的蛋白表达,使得sVEGFR1水平增加。 3IL-4刺激RAW264.7细胞的VEGFR1mRNA表达及sVEGFR1水平表达与P38信号通路密切相关；GM-CSF刺激RAW264.7细胞的sVEGFR1分泌增高有着多种信号通路的参与,其中SB203580可能与其他信号通路有cross-talk使得sVEGFRl分泌机理更复杂。 4在RAW264.7细胞向未成熟DC样细胞发育的过程中,Gadd45a mRNA和Gadd45a蛋白表达增高,当RAW264.