5 mg/kg);Ⅱ组尾静脉注射等量的生理盐水。 2、标本采集:每组分为①肺泡灌洗组和②非肺泡灌洗组两个亚组。
灌洗组在各时间点分别麻醉动物后以生理盐水行支气管肺泡灌洗,留取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)测定BALF中白细胞计数; 非灌洗组各时间点处死动物,取部分右肺制作肺组织匀浆,检测磷酸化P38 MAPK,MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA,肺组织匀浆总蛋白;余下右肺组织称量后置于烤箱中测肺湿/干重比。左肺固定、包埋、切片,用于常规HE染色,观察肺组织病理学变化,拍照存档; 3、肺组织磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)检测(Western blot法):采用改良RIPA缓冲液常规提取肺组织中蛋白质,BCA比色法(Bio-Rad蛋白定量检测试剂盒)测定所提取蛋白的浓度。各组蛋白取样100μg进行SDS- PAGE电泳,电转移至PVDF膜。以封闭缓冲液室温封闭1 h,phospho-P38 MAPK一抗(1∶1000,购自美国SANTA CRUZ公司) 4℃孵育过夜,二抗(1∶2000)孵育1 h,ECL显色。用Q550CW计算机图像分析系统对蛋白条带进行分析处理,蛋白含量用目的条带校正容积(Adj volume) /GAPDH校正容积(Adj volume)表示。 还有 4、肺组织MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA检测(RT-PCR法):(1)按TRIZOL总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)说明书操作。用RNA提取液( TRIZOL Reagent )从肺组织中提取总RNA。(2)逆转录合成互补DNA ( cDNA)第一链。(3) PCR扩增(引物及扩增条件详见实验步骤)。(4)产物分析:扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,用Q550CW计算机图像分析系统进行电泳条带分析。目标产物mRNA表达水平以目的条带校正容积(Adj volume) /GAPDH校正容积(Adj volume)表示。 结果: 1.一般状况:空气组大鼠精神状态佳、活动灵活,实验期间体重增长稳定;高氧组大鼠3天后精神反应差,7天后体重增长不明显,呼吸急促,活动迟缓;SB203580干预组大鼠精神状态稍差、活动稍减少、体重增长不明显,呼吸稍急促。
2.肺组织病理切片:高氧组3天时肺泡腔内有明显出血和炎性细胞渗出,7天时损伤加重,肺间隔增宽,肺组织结构紊乱。SB203580干预组与高氧组比较炎症改变减轻,肺间隔增宽不明显。 也许 3.肺湿/干重比(W/D):实验3天,高氧组较空气组增高(5.5104±0.5001 vs 4.2706±0.3884,p0.05),7天时明显下降(0.9297±0.0642 vs 1.2226±0.1751,p
第一部分不同浓度胰高血糖素样肽-1对乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的作用研究 目的：通过体外培养乳鼠心肌细胞建立缺氧／复氧(H／R)模型,给予不同浓度的胰高血糖素样肽-1进行干预,观察胰高血糖素样肽-1对心肌细胞缺氧／复氧损伤的作用。 方法：1用胰蛋白酶消化法体外原代培养乳鼠心室肌细胞,通过倒置相差显微镜形态学观察以及心肌Q肌动蛋白免疫荧光法进行鉴定。2选用培养72h的单层心肌细胞,实验分为以下7组：正常对照组、单纯H／R组、H/R+GLP-1(0.1nmol／1)组、H/R+GLP-1(1nmol／1)组、H／R+GLP-1 selleck激酶抑制剂 (10nmol／1)组、H/R+GLP-1 (100nmol／1)组、H/R+GLP-1 (1000nmol／1)组。 3化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性,硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量。4通过流式细胞术来检测心肌细胞的凋亡。 结果：1经各项鉴定培养细胞为心肌细胞,且纯度可达90%以上；2 LDH的活性、MDA含量及SOD的活性：与正常对照组相比,单纯缺氧／复氧后,LDH的活性显著增加(83.76±12.21vs16.84±4.43,P＜0.05),超氧化物歧化酶(SOD)的活性明显降低(20.00±4.74vs64.52±6.47,P＜0.05),丙二醛(MDA)含量显著增多(53.74±8.41vs3.90±0.90,P＜0.05),GLP-1预处理后进行H／R,可较大程度地逆转上述指标变化,与H／R组相比均具有显著性差异(P＜0.05),并且随着GLP-1浓度逐渐增加至10nmol／1(0.1nmol／l、1nmol／l、10nmol／1)时LDH活性逐渐下降,MDA含量逐渐下降,SOD的活性逐渐升高,当GLP-l浓度大于1Onmol／l随着浓度增加(10nmol／l、100nmol／l、1000nmol／l),与10nmol／l组相比上述指标改变无统计学意义(P＞0.05)。3心肌细胞凋亡率：正常对照组细胞集中在B3区,在B4区和B2区内几乎无分布,凋亡率为1.2±2.08；H／R组出现大量凋亡细胞,并有部分坏死细胞,其凋亡率为29.1±4.78,较正常对照组显著升高,P<0.05),且在一定的浓度范围内即GLP-1≤10nmol／l时,心肌细胞的凋亡率的下降呈现浓度依赖性(P
钙能够把细胞表面的信号传递给细胞内各过程,从而在动物的细胞里起着一种近乎全能离子信使的作用。体内外的大量研究提出钙有抗肥胖作用,但有些研究者在其他动物模型中却未发现钙的减重现象。p38
MAPK信号通路作为促分裂原活化的蛋白激酶信号通路三条主通路之一,近年来被认为与脂代谢密切相关,且众多研究显示p38 MAPK信号通路的激活与细胞内钙离子[Ca~(2+)]i浓度变化之间存在直接联系。基于钙、p38 MAPK与脂代谢三者之间的交互关系,本试验旨在研究钙调节脂代谢的作用及机理,并尝试探讨钙信号,p38 MAPK信号通路调节脂代谢的潜在分子机制。主要研究结果如下: 1.高脂饲喂小鼠日粮中添加钙显著减少小鼠增重(P<0.01)和SB组(P<0.