成功构建了针对GSK-3β基因一个位点的RNAi腺病毒表达载体,经PCR和测序鉴定干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确;2.在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高滴度腺病毒上清;3.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以高效抑制GSK-3β蛋白的表达,且对GSK-3β蛋白的抑制作用可持续六天以上;4.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以明显增加细胞内β-catenin的蛋白水平,且随着MOI值增加和时间延长β-catenin蛋白量进一步增加;5.腺病毒和/或FFA(0.75 mmol/L)干预HUVEC,72h、96h后Brdu和流式细胞检测,FFA组与正常细胞相比,细胞增殖率明显下降,细胞凋亡率明显增加;RNAi腺病毒组与空病毒组相比,细胞增殖率明显增加,细胞凋亡率差别不明显;RNAi腺病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率增加,细胞凋亡率减少;空病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率和凋亡率差别均不明显。

没有 结论:构建的GSK-3β特异的RNAi腺病毒能够有效抑制GSK-3β基因的表达,增加细胞内β-catenin蛋白水平,可以作为研究Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路的重要技术手段;上调Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路可保护高游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞损伤。
目的:通过研究体外培养的心肌细胞,利用心肌细胞急性缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1(Cardiotrophin-1)对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率,心肌细胞凋亡,心肌肌酸激酶,线粒体模电位(△Ψm)等的影响,探讨CT-1在心肌细胞缺氧复氧损伤中所起的作用及机制,通过CT-1信号通路PI-3K/GSK3β阻断剂LY294002干预,从分子水平阐明PI-3K/GSK3β介导心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用。 方法: 1.乳鼠心肌细胞培养:取出生1-3天的SD大鼠心肌组织,按改良的Simpson等方法进行分次水浴搅拌消化,差速贴壁法纯化心肌细胞,以1×106/cm2的细胞密度接种于35mm培养皿。 查找更多 2.缺氧复氧模型的建立:心肌细胞生长接近会合状态,呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液配制缺氧液,以95%N2-5%CO2预饱和1h,将培养的细胞经缺氧液缺氧3h,之后换成复氧液培养3h。 3.实验分组:(分5组) (1)对照组:更换培养基后CO2孵箱中正常培养; (2)缺氧复氧组:缺氧3h,复氧3h处理; (3)缺氧复氧+CT-1组:缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(4)缺氧复氧+CT-1+LY294002组(PI3K/GSK3β阻断剂):缺氧3h,加入终浓度为10umol/l的LY294002,10min后加CT-1(10ng/ml),再进行复氧3h处理;

(5)缺氧复氧组+CT-1+DMSO组:缺氧3h,加DMSO(助溶剂)10min后加CT-1(10ng/ml),进行复氧3h处理。 结果 1.心肌细胞搏动频率与节律:各组基线心肌细胞搏动频率均为148次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率教复氧前明显减缓,搏动幅度减弱,节律不规整。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧前比较无明显减慢,与对照组相近,节律整齐。而阻断剂LY294002干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则,而助溶剂DMSO并不干扰CT-1的作用。表明LY294002特异性阻断了CT-1对缺氧复氧损伤的心肌细胞的保护作用。

2.心肌细胞的损伤:对照组心肌细胞存活率为96.2±3.2%,凋亡率为2.8±0.4%。缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低,为76.8±4.6%,心肌细胞凋亡率明显上升(19.4±2.3%),二者差异有显著意义(P<0.05),心肌酶LDH和CK-MB较对照组升高。CT-1处理的心肌细胞,明显抑制LDH,CK-MB的升高和凋亡的增加,存活率较缺氧复氧组明显升高(89.8±8.3%VS78.8±4.6%,P<0.01),CT-1组较缺氧复氧升高(69.13±6.84VS40.55±4.25,P0.05),表明CT-1激活了PI3K途径使磷酸化PI3K蛋白水平表达升高。 selleckchem 5.心肌细胞GSK3β蛋白表达和磷酸化状态:各组经3小时缺氧,3小时复氧后,心肌细胞GSK3β蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化GSK3β蛋白表达明显减少,而CT-1组较缺氧复氧组显著上升,加PI3K/GSK3β阻断剂后磷酸化GSK3β蛋白表达明显减少,而助溶剂组与CT-1组无明显差异,表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞磷酸化的作用,PI3K/GSK3β阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 6.心肌细胞Caspases3蛋白表达:各组蛋白上样量无明显差异,经缺氧复氧后,缺氧复氧组较空白对照组Caspases3蛋白表达明显升高(0.953±0.015VS0.329±0.017,P<0.05),CT-1组较缺氧复氧组Caspases3蛋白表达明显减少(0.412±0.034VS0.953±0.015,P0.05),表明CT-1有抑制缺氧复氧心肌细胞凋亡的作用,PI3K/GSK3β阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 结论: 1. CT-1能减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤,表现在:改善心肌细胞搏动频率与节律,提高心肌细胞存活率和降低凋亡率,降低心肌细胞LDH和CK-MB水平。 2. CT-1通过提高心肌细胞线粒体膜电位,降低Caspases3蛋白表达,从而抑制心肌细胞凋亡。 3.

05);IPL+SB203580与对照相比有明显增多(P
目的:探讨内毒素急性肺损伤中丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)、核转录因子κB(NF-κB)与血红素氧合酶-1(HO-1)的相互关系。方法:健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为5组(n=8):对照组或生理盐水组(NS组)、内毒素组(LPS组)、血红素氧合酶-1诱导剂血晶素+内毒素组(Hemin+LPS组)、血红素氧合酶-1抑制剂锌原卟啉IX+内毒素组(ZnPPIX+LPS组)、p38MAPK抑制剂SB203580+内毒素组(SB+LPS组)。气管内滴注LPS或NS6h后检测动脉血气,右肺肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞比、蛋白含量,右肺上叶肺组织湿/干重比;用Westernblotting检测右肺下叶p38MAPK、NF-κB蛋白的表达;用免疫组化检测右肺中叶HO-1蛋白的表达,并进行病理学观察。结果:与NS组比较,LPS组、Hemin+LPS组、SB+LPS组、ZnPPIX+LPS组肺组织湿/干重比明显增加(P<0.05),BALF中性粒细胞比、蛋白含量显著增加(P<0.05或P<0.01),动脉血PaO2、PaCO2和HCO3-显著下降(P<0.05),肺组织p38MAPK、NF-κB蛋白表达明显增高(P<0.05),HO-1强阳性表达(P<0.01或P<0.05),p38MAPK、NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.05),HO-1的表达明显升高(P0.05)。ZnPPIX+LPS组肺组织损伤最重,LPS组次之,Hemin+LPS组和SB+LPS组最轻。结论:在内毒素急性肺损伤中p38MAPK/NF-κB与HO-1相互抑制,各自独立发挥作用。
目的研究瑞舒伐他汀对C反应蛋白诱导的人血管内皮细胞血小板反应蛋白1表达的影响。方法体外培养人血管内皮细胞,ELISA和RT-PCR检测C反应蛋白对血管内皮细胞血小板反应蛋白1表达的剂量与时间效应。Western

时间 通常 blotting检测信号蛋白p38MAPK的表达水平。结果 C反应蛋白以剂量和时间依赖方式显著增加血管内皮细胞血小板反应蛋白1 mRNA表达,p38MAPK表达增加,其抑制剂SB203580减少p38MAPK的磷酸化及血小板反应蛋白1 mRNA表达水平,瑞舒伐他汀显著抑制p38MAPK表达及血小板反应蛋白1 mRNA和蛋白的表达。结论 C反应蛋白至少通过p38MAPK磷酸化途径直接诱导血管内皮细胞血小板反应蛋白1表达,促进细胞炎症反应,而瑞舒伐他汀抑制C反应蛋白的这种效应。
目的:探讨H.pylori感染对人胃癌MKN45细胞环氧合酶2(COX-2)启动子荧光素酶报告基因重组质粒(pGL3-Basic-COX-2-promoter)活性的影响及p38MAPK信号通路对其的调控作用.方法:将构建的COX-2启动子pGL3-Basic-COX-2-promoter和内参质粒pRL-SV40共转染人胃癌MKN45细胞,加入100倍细胞数量的H.pylori共培养一段时间后,检测双荧光素酶的活性.Western

blot检测H.pylori感染对人胃癌MKN45细胞p38MAPK信号通路的激活作用.运用p38MAPK特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号通路,观察H.pylori对MKN45细胞COX-2启动子活性的影响.结果:瞬时转染实验显示,COX-2启动子在MKN45细胞中的转录表达随时间的变化而升高,转染后40h的双报告基因活性是转染后8h的3.5倍(P<0.01);加入H.pylori共培养后,同时间点的荧光素酶活性明显升高(P<0.05或P<0.01),转染后40h的活性是转染后8h的5倍(P<0.01).H.pylori感染20min后,p38MAPK信号通路被激活,60min达峰值;加入p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580抑制p38MAPK信号通路后,COX-2启动子的活性均明显下调.结论:H.pylori感染通过p38MAPK信号通路上调COX-2启动子活性,这可能是H.pylori促进胃癌发生发展的重要因素之一.
目的探讨槲皮素诱导Ⅰ型血红素氧化酶(HO-1)对肝细胞酒精性氧化损伤的保护效应及相关信号通路。方法乙醇(100

Selleck ISRIB mmol/L)孵育的人原代肝细胞经槲皮素(100μmol/L)处理24h后,测定细胞HO-1活性、Nrf2转位表达及细胞相应的氧化损伤程度;在此基础上,联合应用HO-1及各(MAPK)通路抑制剂,观察上述指标的变化。结果槲皮素处理使HO-1进一步升高,并明显减轻乙醇孵育所导致的细胞GSH耗竭、MDA升高及胞内门冬氨酸转氨酶(AST)与乳酸脱氢酶(LDH)的释放;HO-1诱导剂血红素也具有类似的效应,而HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ及p38与细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)抑制剂(SB203580与PD98059)则明显抑制了Nrf2的转位活化及槲皮素的保护效应。结论槲皮素通过诱导HO-1保护肝细胞免受酒精性氧化损伤,其信号通路与p38及ERK活化促使Nrf2转位入核启动HO-1表达有关。
目的研究吡格列酮对抗淀粉样β蛋白片段25-35(Amyloid-β,Aβ25-35)所致培养皮层神经元损伤作用的机制。方法取培养7d大鼠乳鼠大脑皮层神经元,Aβ组加入Aβ25-35(20μmol.L-1)作用24h;吡格列酮组和各种阻断剂组,先加入吡格列酮(0.1、1、10μmol.L-1)或各种阻断剂作用1h,然后加入Aβ25-35(20μmol.

设计合成4组特异性针对PI3K基因的siRNA,构建shRNA质粒载体,感染Ishikawa细胞。2.利用RT-PCR和Western blot技术检测各组对目的基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的靶点。3.将选取的最佳靶点进行包装成慢病毒shRNA载体,感染Ishikawa细胞。4.将感染目的基因的细胞Ishikawa,经流式分选获得稳定的细胞株,采用RT-PCR和Western

CB-839 solubility dmso blot实验检测对目的基因的抑制效果。[结果]1.RT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰靶点,siRNA序列为：GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA2.经测序证实,运用特异性针对PI3K基因的siRNA,成功构建了慢病毒shRNA载体,包装滴度为8×108TU/ml。感染Ishikawa细胞,荧光倒置显微镜下观察及流式细胞仪检测,显示各组感染效率均在90%以上,病毒感染成功。3.经流式细胞仪分选后,RT-PCR和Western blot验证干扰效率,获得稳定转染的细胞株。[结论]RNA干扰技术可有效地抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因的表达,为后续实验奠定基础。第二部分 慢病毒介导的PI3K基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外影响[目的]利用RNA干扰技术抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因的表达,检测PI3K基因低表达后对雌二醇作用Ishikawa细胞后相关基因、蛋白的影响,观察对其存活能力、周期、凋亡影响,探究PI3K基因低表达后对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响及其潜在机制。[方法]1.RT-PCR和Western blot实验检测雌二醇作用感染前后Ishikawa细胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表达。2.MTT实验检测感染前后细胞的生长情况,分析PI3K基因沉默前后对Ishikawa细胞生存率的影响。3.细胞迁移实验Transwell检测感染前后细胞的体外迁移能力,分析PI3K基因沉默前后对Ishikawa细胞的体外迁移能力的影响。4.流式细胞仪检测经雌二醇处理后各组细胞周期及凋亡率的变化,分析PI3K基因沉默后对Ishikawa细胞周期及凋亡的影响。[结果]1.E2作用未转染的Ishikawa细胞后,细胞的VEGF、bFGF基因和蛋白较对照组明显增加(P0.05);

PI3K组细胞VEGF、bFGF基因和蛋白的表达较Ishikawa组相比明显减少,差别有统计学意义(p<0.05)2.MTT实验结果显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,细胞的倍增时间较对照组明显加快(P0.05); PI3K组细胞的倍增时间较Ishikawa组相比明显延长,差别有统计学意义(p<0.05)。3.迁移实验显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,穿过微孔的细胞数较对照组明显增加(P<0.05);PI3K组细胞穿过微孔的细胞个数比Ishikawa组明显减少,差别有统计学意义(p<0.05),表明PI3K低表达可以干扰E2上调子宫内膜癌细胞迁移的能力。4.细胞凋亡结果显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,比对照组总凋亡率(%)下降,差别有统计学意义(p0.05); 和 PI3K组细胞比Ishikawa组中晚期凋亡增加,总凋亡率(%)增加,差别有统计学意义(p0.05);PI3K组细胞与Ishikawa组相比,G0/G1期增加,S期和G2期减少,差别有统计学意义(p0.05);PI3K基因低表达的PI3K组移植瘤增长较Ishikawa组明显减慢,差异具有统计学意义。与Ishikawa组、NC组相比,PI3K组裸鼠移植瘤瘤体重量明显小于其它两组p0.05)。实验PI3K组移植瘤PI3K蛋白的表达量较Ishikawa组及NC组显著降低(P0.05),提示慢病毒介导的PI3K基因RNA干扰载体在体内仍能稳定遗传并高效表达。PI3K组p-Akt、VEGF、bFGF蛋白的表达量比Ishikawa组和NC组均显著降低(P<0.05)。[结论]PI3K基因低表达抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长,提示PI3K基因有可能成为子宫内膜癌的分子靶点。
目的：通过体外实验研究浒苔多糖粗提物对巨噬细胞株RAW264.7增殖，分泌细胞因子IL-6、TNF-α水平等细胞活性的变化，验证其调节免疫作用；并从浒苔多糖粗提物引起RAW264.7中mTOR

很少 mRAN表达变化来探讨可能的活化分子机理，为研究开发浒苔多糖提供依据。 方法： 1.细胞的复苏培养、传代、冻存和实验前处理。 2.检测不同剂量时间浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响：显微镜下观察细胞形态并成像；噻唑蓝（MTT）比色法检测增殖作用； 3.酶联免疫法（ELISA）检测不同剂量/时间浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子IL-6、TNF-α水平的影响； 4. Real Time PCR检测不同剂量/时间浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7mTOR基因表达相对定量变化的影响。 结果： 1.随干预剂量增加，镜下RAW264.7数量增多，体积变大细胞更多，分化愈明显；但随时间延长，RAW264.7数量减小，细胞体积变大。一定作用浓度下有随干预浓度增加相对细胞增殖率呈上升趋势；随时间延长各剂量组吸光度下降，其细胞增殖力减弱。 2.浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7促进分泌细胞因子IL-6、TNF-α：在15.625-1000μg/mL范围内RAW264.7分泌IL-6作用呈剂量依赖性；低浓度范围（500μg/mL以下）RAW264.7分泌呈剂量依赖性，高浓度（1000μg/mL）RAW264.7分泌TNF-α作用减弱。 3. mTOR基因表达：浒苔多糖粗提物对RAW264.7巨噬细胞mTOR基因表达明显促进作用,有一定的剂量依赖性。 结论： 1.浒苔多糖在一定作用浓度范围、时间内有促进巨噬细胞RAW264.7增殖，初步证实其具有促进巨噬细胞增殖的活性，细胞增殖具有剂量依赖性,无细胞毒性,促进巨噬细胞增殖可能是浒苔多糖发挥免疫调节作用的方式之一。 2.浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.

00%和63.49%,而在癌旁正常组织中阳性表达率分别为30.00%和25.00%。P38和JNK在肾透明细胞癌中的表达明显高于癌旁正常组织(p0.05)。对肾透明细胞癌中P38和JNK进行Spearma相关性分析呈正相关(r=0.484,p
骨髓造血组织功能抑制是肿瘤放疗与化疗的常见的副作用,也是高剂量核辐射事故的首要死亡原因,临床上表现为急性和慢性骨髓抑制。急性骨髓抑制即刻出现严重的症状,导致辐射事故受害者与放疗患者的死亡,或者使肿瘤放疗病人的病情恶化。慢性骨髓抑制起病隐匿,病情迁延并且难以康复,而且,由于临床对急性骨髓抑制的治疗掩盖这种难以逆转的骨髓损伤。由于骨髓功能抑制难以治愈,急需对其发病机制进行研究,为骨髓功能抑制的有效治疗与预防提供依据。众多证据表明造血细胞凋亡引发急性骨髓抑制,而造血干细胞的衰老被认为是骨髓长期抑制的主要原因,多项研究表明电离辐射激活p38 GSK1120212 MAPK诱导造血细胞凋亡和衰老。 本研究以P38 MAPK的特异性抑制剂SB203580为研究对象,研究其对全身照射小鼠造血细胞的辐射保护作用,并初步探讨其作用的机制。包括三部分实验：1)SB203580对造血祖细胞和造血干细胞保护作用的观察：小鼠随机分为对照组、照射组及SB203580给药组,以6.0

Gγ137Csγ射线全身均匀照射SB203580给药组和照射组的C57BL/6小鼠。收集并计数外周血红细胞、白细胞和血小板,以及单侧股骨骨髓有核细胞；骨髓细胞半固体培养法检测骨髓有核细胞增殖能力,卵石样造血集落形成实验检测造血干细胞增殖能力。2)SB203580的抗氧化作用：收集小鼠骨髓有核细胞,分组同上,照射组与SB203580给药组细胞进行1Gγ体外照射,照射之后孵育过夜,酶标仪检测细胞内活性氧水平。3)SB203580对造血干细胞样细胞p16 mRNA表达的影响：磁珠分离小鼠系标记阴性骨髓造血细胞,分为对照组、照射组、照射+放线菌素D组、照射+SB203580组、照射+SP600125组,细胞照射剂量为4Gγ。培养后去除悬浮细胞,消化贴壁细胞后重新贴壁取非贴壁细胞为干细胞样细胞,提取RNA, selleck化学 Real-time PCR检测p16与p21 mRNA的表达情况。 本研究观察到SB203580给药组外周血白细胞、血小板的数量分别比照射组高111.8%和157.7%(P<0.05),CAFC阳性细胞形成率较照射组高146.6%(P<0.01)。SB203580处理组体外受照骨髓有核细胞内活性氧较照射组低56.2%(P
目的:了解C型钠尿肽前体氨基末端肽(amino-terminal

proCNP, NTproCNP)在正常儿童及原发性甲状腺功能减低症、特发性中枢性性早熟(ICPP)等生长异常儿童血清水平,探讨NTproCNP与身高、骨龄、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、骨钙蛋白(osteocalcin ,OC)、骨碱性磷酸酶(bone specific alkaline Metformin phosphatase, BAP)的相互关系,从而确立血清NTproCNP对评价儿童骨骼生长潜能的临床价值。 方法:所选61例儿童(其中原发性甲状腺功能减低症22例,ICPP 21例,正常儿童18例)均来自于我院儿科生长发育专科门诊。测定其身高,采用CHN法评定手、腕部骨化指标,计算骨龄。采集上述儿童8:00-9:00时空腹取静脉血4ml,室温下静置15分钟,待血液凝固后,3000r/min离心5min,分别留取血清,置-20℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清NT-proCNP、IGF-1、OC、BAP水平。SPSS14.0统计软件进行统计学分析。对资料进行方差齐性及正态分布检验,计量数据以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较用t检验,两变量之间相关性用Pearson相关分析。 结果:1、正常儿童血清NTproCNP、IGF-1、OC、BAP水平分别为22.47±16.62pmol/L,364.15±191.34ng/ml,97.59±30.62ng/ml,143.36±32.52 U/L;身高、骨龄、年龄分别为137.54±15.27cm, 10.41±2.42岁,10.27±2.36岁;NTproCNP与其他血清学指标和生长发育指标之间无明显相关性,相关系数分别为r=-0.062,r=-0.007,r=-0.236,r=-0.131,r=-0.103,

r=-0.115,均P>0.05。IGF-1与年龄、骨龄和身高有高度正相关性。2、原发性甲状腺功能减低症儿童血清NTproCNP、IGF-1、OC、BAP水平分别为22.93±23.37pmol/L,257.88±100.59ng/ml,98.06±32.79ng/ml,120.67±47.37 U/L,身高、骨龄、年龄分别为128.57±11.23cm, 8.82±2.38岁,11.66±2.23岁;NTproCNP与其他血清学指标和生长发育指标之间无明显相关性,相关系数分别为r=-0.167,r=0.315,r=0.421,r=-0.215, r=-0.241,r=0.315,均P>0.05,血清IGF-1与年龄、骨龄和身高有高度正相关性。3、ICPP儿童血清NTproCNP、IGF-1、OC、BAP水平分别为11.75±4.85pmol/L,573.38±229.55ng/ml,86.17±18.23 ng/ml,116.96±27.18U/L,身高、骨龄、年龄分别为144.84±11.10cm, 12.09±1.76岁,9.78±1.90岁;NTproCNP与IGF-1和骨龄呈负相关,相关系数分别为r=-0.456(p=0.038),r=-0.541(p=0.011),IGF-1与身高、年龄、骨龄呈高度正相关。4、原发性甲减儿童与正常儿童血清NTproCNP、IGF-1、OC、BAP水平无明显差异,均P>0.

1、1.0、10.0及100.0 nmol/L,干预时间均为6 h)和不同时间(空白对照组加入PBS溶液,4个干预组胰蛋白酶的终浓度均为10.0 nmol/L,相应的干预时间分别为3、6、12及24 h)的胰蛋白酶干预后,检测MKN28细胞中VEGF m RNA及其蛋白的表达水平,并检测培养液中VEGF蛋白的浓度。2将MKN28细胞分别给予PBS溶液(空白对照组)、胰蛋白酶、胰蛋白酶+PD98059、胰蛋白酶+SB203580、PD98059及SB203580处理,检测MKN28细胞中VEGF

m RNA及其蛋白的表达水平。细胞中VEGF m RNA及其蛋白表达水平的检测分别采用荧光定量PCR法和Western blot法,培养液中VEGF蛋白浓度的检测采用酶联免疫吸附实验(ELISA)。结果 点击此处 1胰蛋白酶浓度的影响。与空白对照组比较,0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L组细胞中VEGF m RNA及其蛋白的表达水平均较高(P0.05)。空白对照组、0.1 nmol/L组、1.0 nmol/L组、10.0 nmol/L组及100.0 nmol/L组培养液中VEGF蛋白的浓度逐渐递增(P0.05)。空白对照组、3 h组、6 h组、12 h组及24 h组培养液中VEGF蛋白的浓度逐渐递增,5组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05),但胰蛋白酶组细胞中VEGF m RNA及其蛋白的表达水平均较其余5组相应指标高(P
目的探讨细胞外信号调节激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(ERK/p38MAPK)信号通路在参苓白术散调控脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织水通道蛋白(aquaporin,AQP)3、AQP4表达中的作用。方法将60只Wistar大鼠按照随机数字表均分为正常组、模型组(氯化钠注射液)、参苓白术散组、U0126+参苓白术散组、SB203580+参苓白术散组。除正常组外,脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠采用2,4,6-三硝基苯磺酸/乙醇灌肠,结合环境与饮食干预复制。14 d后采用蛋白质印迹法检测各组大鼠结肠组织AQP3、AQP4蛋白的表达,实时荧光定量PCR法检测其mRNA表达情况。结果模型组大鼠AQP3、AQP4蛋白表达及其mRNA的表达水平明显低于正常组(P<0.05),参苓白术散组大鼠结肠组织AQP3、AQP4蛋白及mRNA表达较模型组明显升高,组间比较有显著性差异(P<0.05),SB203580+参苓白术散组及U0126+参苓白术散组大鼠结肠组织AQP3、AQP4蛋白及mRNA表达较模型组有较小幅度升高,与正常组和参苓白术散组相比均有显著性差异(P
目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎大鼠肠道动力障碍中的作用。方法 34只Sprague-Dawley大鼠用随机数字表法随机分成4组:正常对照组(正常组,n=8),DSS模型组(DSS组,n=8),DSS+生理盐水(NS)组(DSS+NS组,n=9),DSS+SB203580干预组(SB203580组,n=9)。除正常组外,所有大鼠每日饮用5%DSS溶液,SB203580组大鼠在饮用5%DSS溶液72

寻找更多 h以后,每天予以SB203580(1 mg/kg体质量)进行腹腔注射,观察各组大鼠的疾病活动指数(DAI),以酚红法测定大鼠结肠传输功能。结果 1 DSS组和DSS+NS组大鼠的DAI评分明显高于正常组,SB203580组DAI评分明显降低,但仍然高于正常组(P0.05)。2与正常对照组比较,DSS组和DSS+NS组大鼠的结肠传输功能明显延迟,经SB203580干预后,其结肠传输功能明显改善(P0.05)。结论 SB203580能阻断p38MAPK信号转导通路,改善DSS诱导的结肠炎症,从而改善结肠传输功能。
目的:观察P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 还有 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)抑制剂SB203580对TNF-α诱导的原代培养大鼠小胶质细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility

group protein B1,HMGB1)表达的影响。方法:采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立对照组、TNF-α组(25 ng/m L)、TNF-α(25 ng/m L)+SB 203580组(10μmol/L)、SB203580组(10μmol/L),各组细胞经药物处理16 h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1的表达情况,Western印迹检测细胞HMGB1和磷酸化p38MAPK表达情况,用反转录PCR检测HMGB1 m RNA表达。结果:经TNF-α刺激后,大鼠小胶质细胞及其培养上清液中HMGB1蛋白表达增高;SB 203580可抑制TNF-α诱导的磷酸化p38 MAPK表达(P
目的探讨P38MAPK通路对肝癌细胞增殖的影响.方法描绘生长曲线、MTT、台盼兰染色、共聚焦显微镜、Western Blot和原位细胞凋亡检测.研究正常肝细胞、癌周肝硬化细胞和肝癌细胞3株细胞在P38MAPK通路阻断前后增殖情况变化.结果 P38MAPK抑制剂对肝癌细胞的增殖影响最大,随着抑制剂浓度增加,增殖越明显.而对癌周肝细胞和正常肝细胞表现为低浓度促进增殖,高浓度抑制增殖.结论阻断P38MAPK的活化可以促进肝癌细胞的增殖.
目的研究天山雪莲愈伤组织提取物(extract from callus of Saussureainvolucrate,ESI)对人成骨肉瘤细胞MG-63增殖及分化的影响,探讨ESI抗骨质疏松的作用及机制。方法以MG-63为研究对象,采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)法检测ESI对成骨细胞增殖的影响,相关试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性和羟脯氨酸(Hyp)水平,茜素红染色法观察对矿化骨结节形成的影响;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测骨保护素(OPG)和核因子-κB活化因子受体配体(RANKL)基因表达水平;Western blotting法检测OPG/RANKL蛋白水平;检测p38特异性抑制剂SB203580对ESI作用于成骨细胞增殖、分化、矿化以及OPG/RANKL表达的影响。结果 ESI低于125μg/mL对成骨细胞无细胞毒性,31.25、62.

1、Zscan4d、Mu ERV-L和e IF-1A等ZGA标志基因m RNA的表达水平。5.收集KM小鼠1细胞胚,分别置于KSOM和含API-2(2μM)的KSOM培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,运用Real-Time PCR技术检测干细胞因子Oct4和Sox2的m RNA表达水平。结果:1.p-Ser473-Akt和pan-Akt存在于小鼠植入前胚的1-细胞至4-细胞阶段。作为Akt主要的活性形式,p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化,其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相(minor PD0325901小白鼠 ZGA和major ZGA)基本一致。pan-Akt主要分布在胞质里,在不同发育阶段的细胞中其表达和定位没有发生明显的改变;2.Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性。一定浓度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使体外培养的1-细胞胚出现“2-细胞阻滞”现象;3.2.0μM API-2和30μM MK2206阻滞的2-细胞胚内,p-Ser473-Akt在细胞核内的表达发生了明显的下调,而pan-Akt的定位与表达并没有产生明显的变化;4.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内,Mu ERV-L和e IF-1A的m RNA水平明显低于KSOM对照组(P0.05)。5.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内,干细胞因子Oct4的m RNA水平明显低于KSOM对照组(P0.05)。结论:Akt主要活性形式p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化,其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相(minor

ZGA和major ZGA)基本一致,提示p-Ser473-Akt可能参与ZGA过程。Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用,一定浓度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使体外培养的1-细胞胚出现“2-细胞阻滞”现象,同时,也使2-细胞胚核内p-Ser473-Akt表达水平下降。且一定浓度的API-2(2.0μM)使2-细胞胚内ZGA标志基因Mu AZD6244半抑制浓度 ERV-L和e IF-1A,以及干细胞因子Oct4的m RNA水平明显下调。这些结果进一步证实,Akt特异性抑制剂诱导产生的“2-细胞阻滞”,以及ZGA启动失败和干细胞因子Oct4表达下调与其降低核内p-Ser473-Akt表达水平有关。
背景与目的：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)作为一种信号鞘磷脂，绝大多数与高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)结合，并介导HDL诸多生物功能如抗动脉粥样硬化、抗血栓和保护血管内皮等。S1P通过其5个受体(S1PR1~S1PR5)激活细胞内复杂的信号转导通路实现生物功能多样化。其中S1PR1/3在细胞增殖、血管发生和重建、神经形成、免疫细胞迁移、炎症反应、内皮细胞屏障功能等方面发挥重要作用，但有关S1PR1/3对巨噬细胞内胆固醇代谢的影响未见报道。因此，本论文主要探讨S1P通过S1PR1/3对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的调控作用及其信号机制，为全面了解S1P的抗动脉粥样硬化机制提供新的理论基础。 方法：1.佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)诱导THP-1单核细胞24h后，选择不同时间和浓度的S1P进行处理，人胆固醇Elisa试剂盒检测细胞培养液中胆固醇含量。2.分别用VPC23019(S1PR1/3抑制剂，10μM)和JTE-013(S1PR2抑制剂，10μM)孵育THP-1源性巨噬细胞12h，然后加BODIPY-Cholesterol孵育过夜，激光共聚焦显微镜下观察胆固醇分布、定位和含量变化，同时用油红O染色显示细胞内脂质蓄积情况。3. VPC23019(10μM)处理THP-1源性巨噬细胞4h后，WesternBlot检测PI3K-Akt信号通路及NF-κB(P65)的蛋白活性，VPC23019(10μM)处理THP-1源性巨噬细胞24h后，Western Blot检测LXR及其下游基因ABCA1和ABCG1蛋白表达水平。4.分别以LY-294002和MK2206阻断P13K-Akt信号通路后，采用Western

Blot检测ABCA1的蛋白表达水平，RT-PCR检测ABCA1和ABCG1的mRNA表达水平，BODIPY-Cholesterol荧光探针结合荧光显微镜，观察THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量，荧光分光光度计检测培养液中胆固醇浓度和胆固醇外流情况。 一般 结果：1.1μM S1P处理THP-1源性巨噬细胞24h，培养液中胆固醇含量达到最高。 2. THP-1源性巨噬细胞胆固醇大部分选择性定位于细胞胞膜上，S1P可降低THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量。3.与对照组相比，S1PR1/3抑制剂VPC23019下调THP-1源性巨噬细胞PI3K-Akt信号通路活性，并增加NF-κB (P65)蛋白活性，降低LXR、ABCA1和ABCG1的蛋白表达水平。4.分别用S1PR1/3抑制剂、PI3K抑制剂和Akt抑制剂阻断S1PR1/3-PI3K-Akt信号通路后，ABCA1和ABCG1的蛋白及mRNA表达水平下降，THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量增加，胆固醇外流减少。 结论: 1.S1P促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出。 2.S1PR1/3-PI3K-Akt信号转导通路参与S1P对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的调控作用。
随着分子生物学的研究发展，肿瘤的发病机制的认识逐渐深入，从过去的单一因素研究上升到多因素致病理论。研究肿瘤细胞增殖过程和细胞信号通路机理与药物的关系，为抗肿瘤药物研究开辟新的道路。具有潜在抗肿瘤活性的苯并咪唑及三联吡啶衍生物已大量进行研究，本论文以此为配体，合成了两个系列的钌配合物，通过对其进行抗肿瘤活性的筛选及细胞凋亡机制研究，结果表明抗肿瘤活性高且毒副作用较小的硝基苯并三联吡啶钌配合物可作为继续进行研究的潜在抗肿瘤药物。其主要结果如下： 设计并合成了两个系列钌配合物，其中包括八个苯并三联吡啶衍生物钌配合物和六个苯并咪唑吡啶类钌配合物，通过ICP-AES、ESI-MS、1HNMR、IR等方法对所合成的配合物进行表征，其结果与预期一致，表明所合成的配合物为目标产物。 选择多种肿瘤细胞株和正常细胞株，通过检测细胞存活的方法对所合成的配合物进行抗肿瘤活性筛选，结果表明所合成的配合物对所选癌细胞株都明显具有抑制生长作用，对正常细胞毒性较小；配合物的抗肿瘤活性并不完全同配体的共轭π键大小成正比；在配体上引入基团会影响其抗肿瘤活性；硝基的引入极大提高了配合物的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性同顺铂相当的硝基苯并三联吡啶钌配合物抑制A375恶性黑色素瘤细胞的IC50值为16.9μM，硝基苯并咪唑吡啶钌配合物抑制Nerua-2a神经胶质瘤细胞的IC50值为5.

氯化锂可抑制奥曲肽对结肠癌SW480细胞Wnt/β-Catenin信号通路的作用,提示奥曲肽对Wnt/β-Catenin信号通路的抑制作用与其增强GSK-3β的活性有关。
研究背景： STAT抑制剂 特发性肺纤维化(IPF)是一种以肺内成纤维细胞不明原因的异常增殖形成瘢痕组织为主要特征的进行性肺部纤维化疾病,其病理机制目前还不清楚。有研究表明Wnt/β-catenin信号通路在成纤维细胞激活、增殖过程中具有重要调节作用,同时在IPF病人的肺组织中也发现了Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。另外,由于骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)具有分化为包括上皮细胞谱系在内的多向分化潜能,有研究试图利用BM-MSCs分化为肺泡上皮细胞来修复肺纤维化,但因BM-MSCs具有向上皮细胞或成纤维细胞分化的双向分化可能,具体修复效果目前尚无定论。有研究证实Wnt/β-catenin信号通路参与了BM-MSCs向上皮细胞的分化。 考虑到Wnt/β-catenin信号通路在以上过程中的重要作用,本实验以该信号通路为靶点,采用小鼠腹腔注射Wnt/p-catenin言号通路抑制剂XAV939以观察其对博来霉素诱导的肺纤维化的作用；同时运用Trans-well细胞共培养技术构建小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ细胞)共培养诱导分化体系,以观察在共培养条件下XAV939对BM-MSCs向肺泡上皮细胞分化过程的影响。这将为通过抑制Wnt/p-catenin信号通路治疗肺纤维化这一新思路提供重要的实验基础。

研究目的： 1、确认XAV939能够抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的发展；2、构建BM-MSCs与ATⅡ细胞共培养诱导分化体系,证明在共培养条件下XAV939能够促进BM-MSCs向肺泡上皮细胞分化。 研究方法： 1、采用SPF级雄性十周龄C57BL/6小鼠腹腔麻醉后鼻腔滴注博来霉素。分别于给药后第7天、14天和21天处死小鼠,采用组织切片染色、羟脯氨酸含量测定、RT-PCR和Western blot等技术检测肺纤维化的发生、发展以及Wnt/β-catenin信号通路中相关因子的表达情况。 2、在小鼠肺纤维化模型建立的基础上,于博来霉素鼻腔滴注后第10天开始腹腔注射XAV939,连续注射7天。在第17天处死小鼠,采用组织切片染色、羟脯氨酸含量测定、]RT-PCR和Western blot等技术检测肺纤维化的发生、发展以及Wnt/β-catenin信号通路中相关因子的表达情况。 3、小鼠鼻腔滴注高剂量博来霉素(17天大部分死亡的剂量),在第10天开始腹腔注射XAV939,连续注射7天。每天观察并记录小鼠死亡情况。

4、采用CCK-8法体外检测XAV939对NIH-3T3成纤维细胞增殖能力的影响。 5、运用Trans-well方法建立BM-MSCs与ATII细胞的共培养体系。将两种细胞以8：1的比例分别接种到六孔板和小室内,并在培养基中加入XAV939。连续共培养至14天,用免疫荧光、RT-PCR和Western 那个 blot等技术检测诱导分化的BM-MSCs中肺泡上皮细胞标记角蛋白18(Keratin18, Krt18)、角蛋白19(Keratin19, Krt19)、闭合蛋白(Occludin, Ocln)以及表面活性蛋白C (Surfactant protein C, Sftpc)的表达情况。 研究结果： 1、博来霉素可以诱导小鼠肺纤维化,在此过程中伴有Wnt/β-catenin信号通路的激活。鼻腔滴注博来霉素引起肺泡间出现炎症细胞弥漫浸润,纤维组织增生,肺泡间隔显著增宽,肺间质中胶原纤维沉积量加大,纤维化相关分子表达量上升；同时伴有Wnt/β-catenin信号通路相关因子表达上调,组织内β-catenin含量上升。 2、XAV939能够抑制Wnt/p-catenin信号通路的激活并修复肺组织、抑制肺纤维化的发展。在腹腔注射XAV939后,Wnt/β-catenin信号通路和纤维化相关因子表达下调,组织内β-catenin含量下降,纤维组织增生面积显著减少,胶原纤维沉积量降低。 3、XAV939提高了鼻腔滴注高浓度博来霉素后小鼠的生存率。 4、XAV939能够抑制NIH-3T3成纤维细胞的增殖活力。 5、运用Trans-well技术成功建立了BM-MSCs与ATⅡ细胞共培养诱导体系。在共培养体系中,XAV939能够促进BM-MSCs呈现上皮样形态,表达上皮细胞特异性标记Krt18, Krt19, Ocln以及Sftp。 结论： 在体内实验中,我们证实XAV939可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活并促进纤维化肺组织的修复,提高高浓度博来霉素损伤后小鼠的生存率；在体外实验中,XAV939可以抑制NIH-3T3成纤维细胞增殖,促进共培养体系中BM-MSCs向肺泡上皮细胞分化。这为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路与肺纤维化的发生、发展得关系提供了一定的实验基础,对肺纤维化的治疗具有临床指导意义。
研究背景 整联蛋白连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)第一次被发现于1996年,是一种定位于细胞粘着斑部位的丝氨酸／苏氨酸的蛋白激酶。现已探明,ILK在多种细胞通路和功能中起到至关重要的作用,包括细胞的生长、发育、分裂、增殖、分化、迁移和血管发生等。很多研究表明,在病变的癌细胞中,ILK的表达较之正常细胞明显升高,说明其对癌症的发生和治疗密切相关。目前的研究表明,ILK在神经系统的各个脑区都有很高的表达量,说明它可能在神经系统中也发挥着巨大作用。通过基因敲除ILK的方法检测发现,与正常小鼠相比,基因敲除ILK的小鼠神经系统发育出现了缺陷,其皮层结构完全紊乱,小脑脑叶数目减少,脑叶融合,海马齿状回部位出现了锯齿状的颗粒层结构等等。进一步的研究发现,神经生长因子(nerve

无 growth factor, NGF)刺激下引起的突起生长或是树突生长依赖于ILK的作用,当抑制ILK之后,突起生长明显受到抑制,这些结果,都说明ILK在神经系统的正常生长发育过程具有重大意义。然而,目前关于ILK在成年动物高级功能如学习记忆中的作用以及机制尚不清楚。本论文使用多种研究方法从分子到整体水平阐明了ILK在丰富环境增强记忆中的作用及机制,并初步探究了其在改善APP/PS1转基因小鼠记忆缺陷中的作用,为今后临床治疗阿尔兹海默病提供了实验依据。 研究目的 1.ILK是否参与丰富环境增强记忆的过程。 2.ILK通过何种机制参与丰富环境增强记忆的过程。 3.调节ILK的功能能否改善APP/PS1转基因小鼠记忆能力的缺陷。 研究方法 1.丰富环境训练以及ILK蛋白、mRNA检测 1.1丰富环境训练 将小鼠置于放置有滚轮、梯子、隧道、滚球等玩具的环境中,观察随着时间推移ILK蛋白量的变化。 1.2ILK蛋白、mRNA检测 采用western blotting和RT-PCR的方法,检测ILK蛋白和mRNA水平的变化。 2.病毒干预对神经再生和学习记忆的影响 2.

05），增加活细胞比率（P<0.05），减少细胞的坏死比率（P<0.05），同时减少KIM-1蛋白的表达量（P<0.05）。加入EPO可以减少HKC细胞在CsA作用下产生KIM-1蛋白（P
研究背景

寻找更多 转化生长因子-β (TGF-β)在调节心血管生理和疾病中发挥多种作用,而其中重要的作用之一就是调节血管系统中的内皮细胞功能。TGF-β信号通路的失衡会导致胚胎血管发育的异常,而且TGF-β在出生后毛细血管新生中发挥重要的作用。除此之外,研究结果提示TGF-β能调节内皮细胞的增殖,凋亡,通透性变化和形态发生。有证据表明在有心血管疾病危险因素的患者中TGF-β血浆浓度是升高的,这些危险因素包括肥胖和糖尿病。而且,研究检测到患有先兆子痫的女性循环血中TGF-β的水平是升高的。在易患动脉粥样硬化的载脂蛋白E基因敲除小鼠中,TGF-β表达增加导致内皮细胞氧化应激和内皮功能紊乱。重要的是,TGF-β在内皮细胞中的生物学作用往往是矛盾的(或有保护作用或者是有害的),作用的不同取决于细胞的环境和细胞的类型。 在内皮细胞中, TGF-β发挥作用主要由活化素受体样激酶1(ALK1)和ALK5两种膜受体介导。激活的ALK1受体磷酸化Smadl/5/8,然而ALK5的激活引起Smad2/3的磷酸化。这些活化的Smad蛋白与Smad4结合,作为一个转录激活复合物调节各种各样靶基因的表达,然而ALK1和ALK5的激活可能会引起不同的内皮细胞生物学效应。除这些经典信号途径外,最近研究提示NADPH氧化酶依赖的氧化还原机制或许介导了TGF-β生物学作用的调节。特别是,TGF-β特异性上调多种细胞中Nox4型NADPH氧化酶的表达。更重要的是,这些研究证实阻断Nox4的表达或功能抑制TGF-β对多种细胞功能的影响,提示Nox4在TGF-β信号通路中发挥重要的作用。

多项证据表明TGF-β能引起不同类型内皮细胞的凋亡,然而TGF-β引起凋亡的信号机制还知之甚少。研究证实TGF-β引起肺毛细血管内皮细胞凋亡,这种作用依赖于ALK5-Smad2通路和下调抗凋亡基因Bcl-2和cFLIP。另一方面,多项研究指出p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)介导了TGF-β引起的内皮细胞凋亡。然而,迄今为止鲜有研究表明TGF-β引起的内皮细胞凋亡涉及氧化还原依赖的信号途径。鉴于最近的结果显示活性氧簇(ROS)生成的增加或许在TGF-β引起的内皮细胞的凋亡中有重要作用,我们提出以下假设：Nox4依赖的氧化还原调节途径或许介导了TGF-β引起的内皮细胞的凋亡。 研究目的 1. TGF-β在内皮细胞凋亡中的作用 2.Nox4氧化还原信号通路是否介导了TGF-β引起的内皮细胞凋亡 Tofacitinib 3.MAPK信号通路在TGF-β引起内皮细胞凋亡中的作用及机制研究 Ivacaftor半抑制浓度 研究方法 1.人内皮细胞培养 人脐静脉内皮细胞HUVECs和永生化的人微细血管内皮细胞HMVECs购买自ATCC。细胞在含有5%胎牛血清的完全内皮细胞培养基(ECM)中培养,置于5%CO2,37℃条件的细胞培养箱中。待细胞长至融合时,用胰酶消化细胞进行传代培养,第3到6代之间的HUVECs用于实验。

2.Caspase3/7活性测定 培养在96孔板中的细胞经药物处理后,加入Caspase-Glo3/7试剂检测Caspase3/7活性。样品转移到白色96孔板中,用全波长扫描式多功能读数仪进行读板测定。 3.蛋白质免疫印迹 处理细胞后,用裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,封闭后用特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温2小时。ECL化学发光液显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测。 4. TUNEL法检测细胞凋亡 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(TUNEL)法按照Millipore的步骤进行,其中标记的棕褐色为凋亡细胞的细胞核,绿色为正常细胞。随机取10个视野计数TUNEL阳性的细胞和总细胞数,TUNEL阳性细胞与总细胞的比值作为细胞凋亡率。 5.ROS检测 细胞内的ROS用DCFH-DA荧光染料检测,处理后的细胞加入DCFH-DA在37。C孵育20分钟并用激光共聚焦显微镜拍照留取图片,或者将DCFH-DA孵育的细胞悬液转移到96孔白板中检测荧光强度。 6.线粒体膜电位(△ψm)的检测 荧光探针JC-1用来检测线粒体膜电位的变化。药物处理后的细胞用JC-1进行染色,然后流式细胞术或者激光共聚焦显微镜检测红绿荧光的变化。 7.Nox4干扰试验 从备选的3条Nox4shRNA中挑选出干扰效率最高的一条进行实验,携带有Nox4shRNA和对照shRNA的慢病毒载体由上海吉玛公司构建。其中靶向Nox4的shRNA序列是5′GCTGTATATTGATGGTCCTTT3′,对照shRNA序列为5′GGTGTCTTCGAATTTATGTCT3′。将慢病毒转染细胞48小时后进行后续实验。 8.实时荧光定量PCR检测mRNA水平的表达 TRIzol试剂提取处理细胞的总RNA,逆转录成cDNA,再用Taqman探针-引物体系进行PCR,18S作为管家基因检测：mRNA表达的相对变化。 9.细胞免疫荧光法 培养于Lab-Tek腔室玻片上的细胞固定后,加一抗和荧光二抗孵育,用DAPI复染细胞核,激光共聚焦显微镜拍照。 10.统计学分析 数据用均数±标准误表示,用SPSS18.

禽流感病毒H5N1的NA接种小鼠引起小鼠肺脏Th17细胞数量增加。 通过对5周龄的小鼠鼻腔接种H5N1的神经氨酸酶,取小鼠肺脏组织的T细胞进行流式细胞术检测Th17和Treg细胞分化。结果发现,经过H5N1的神经氨酸酶感染后的小鼠肺脏Th17的细胞比例显著上升,并且呈现剂量依赖性。

2.禽流感病毒的NA能诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟 通过小鼠BMDC的体外培养,用脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),H1N1的NA,H5N1的NA,H9N2的NA及热灭活的H5N1的NA以及卵清蛋白(OVA)分别在BMDC培养的不同时间段对树突状细胞进行刺激,然后通过流式细胞术检测树突状表面的MHC-11分子以及共刺激分子CD40, CD80, CD83和CD86。结果发现,禽流感病毒的NA均能促进树突状细胞的成熟,并且在一定范围内存在剂量依赖性,并推测是NA的酶活性促进了树突状细胞的成熟。 3.禽流感病毒H5N1的NA能诱导Th17及其它CD4+T细胞分化 通过小鼠BMDC和小鼠脾脏CD4+T细胞体外共培养,用H5N1的NA以及其他的样品对共培养的细胞进行刺激,并利用ELISA,荧光定量PCR以及流式细胞术对各个样品进行检测。结果发现,H5N1的NA能通过BMDC在第五天和第九天诱导小鼠Th17及其它CD4+T细胞分化。通过实验结果推测,早期由IL-21和TGF-β,随后由IL-6和TGF-β主导CD4+T细胞的Thl7分化。在此过程中,H5N1的NA能诱导相应各类炎症因子的释放,如TGF-β1、IL-6、IL-21、IL-23、IL-1β、IL-17A、IL-10等。
转化生长因子-β GSK1120212供应商 (transforming growth factor-p, TGF-p)信号通路在细胞生长、增殖、分化、凋亡以及胚胎的发育中都具有极其重要的作用,TGF-β信号通路能否得到正常调节与人类多种疾病的发生密切相关。Smad家族蛋白是TGF-β信号通路中的关键信号转导蛋白,它们主要包括受体调节型Smad (receptor regulated Smad, R-Smad),通用转导型Smad (common mediator Smad, Co-Smad, Smad4)以及抑制型的Smad (inhibitory Smad, I-Smad)。 Smad4在整个TGF-p信号通路中起着核心的作用,它在受到TGF-β刺激后,能够与R-Smads相结合,从细胞质转移到细胞核,在核内Smad4能够与不同的转录调节因子结合调控下游基因的表达,从而调控TGF-p信号所介导的各种生理效应。 BRD7(bromodomain containing7)最早是从鼻咽癌细胞与正常细胞的基因差异表达筛选中得到的。BRD7是染色体重组复合物SWI/SNF的一员,能够通过Bromo结构域与组蛋白结合进而影响染色体重组。已有研究表明,BRD7能够参与WNT、ras/MEK/ERK以及Rb/E2F信号通路的转导,但是BRD7在TGF-β信号通路中的研究目前还没有报道。

为什么 本研究通过酵母双杂交实验发现了BRD7与TGF-β信号通路关键因子Smad4具有相互作用,之后我们分别在体内和体外证实了BRD7与Smad4的确存在相互作用,并且找到了其相互作用的区域。随后,我们通过荧光素酶报告基因实验证明了BRD7是TGF-p信号通路的促进因子。同时,通过对TGF-p信号通路诱导的下游基因表达的检测验证了这一促进效应。BRD7调节TGF-p信号通路的转导主要通过两方面。一方面,BRD7能够通过Bromo结构域结合乙酰化的H3K9从而促进Smad4结合DNA,另一方面,BRD7与p300的相互作用能够促进Smad4的转录活性。最后,我们在细胞水平上证实了BRD7能够影响TGF-β信号通路调控的细胞增殖、细胞周期及上皮细胞向间充质细胞的转变(epithelial-mesenchymal

transition, EMT)现象等功能。 综合我们的研究表明,BRD7蛋白能够通过对TGF-β信号通路关键因子Smad4的调节参与TGF-β信号通路的转导,并且能够影响TGF-β在细胞水平上对多种细胞行为的调节。此研究为进一步理解TGF-p信号通路的调节机制以及进一步理解BRD7在癌症发生中的功能和机制提供理论依据的基础。
转化生长因子-β (Transforming Growth Factor-β或者TGF-β)作为一种重要的细胞因子在细胞的生长、增殖、分化中发挥着非常重要的调控作用。因此,TGF-β信号通路的调控异常与人类多种疾病密切相关如癌症等。在TGF-β信号传递过程中Smads蛋白发挥了重要的作用。Smads家族蛋白根据其结构和功能可以分为三大类,分别是受体激活的R-Smads(如Smad2/3),通用转导的Co-Smad,以及抑制型的I-Smads,在经典的TGF-β信号通路中,配体与细胞表面的受体结合,从而引起R-Smads的磷酸化。磷酸化的R-Smads与Co-Smad结合形成三聚体进入细胞核,结合到特定的DNA序列从而调控下游基因的表达。 还有 在TGF-β信号通路中,转录水平的研究已经比较清楚,但是转录后水平的调控机制还不是非常清晰。基因在转录后,需要经过剪接加工成为成熟的mRNA,最后翻译成为蛋白质。经典的转录后剪接加工调控主要是通过RNA结合蛋白识别mRNA上的增强或抑制单元来实现的。在TGF-β信号通路中,RNA结合蛋白如何参与其转录后调控的机制还不清晰。本研究拟以构建RNA结合蛋白文库为载体,结合细胞水平和分子水平的实验,研究RNA结合蛋白在TGF-β信号通路中的调控作用。 根据RNA结合蛋白数据库中的信息,在人类细胞中有235个蛋白含有一个或多个RNA结合单元(RNA Recognition Motif或者RRM)。对照cDNA文库(Human ORFeome5.

5 μmol/L HX531). The cell viability was measured by MTT, apoptosis rate of cardiomyocytes by flow cytometry analysis, and mitochondrial membrane potential(ΔΨm) by JC-1 fluorescent probe, and protein expressions of Bcl-2, Bax Proteasomal 抑制剂s and cleaved caspase-9

with Western blotting. All measurement data were expressed as mean±standard deviation, and analyzed using one-way ANOVA and the Dunnett test. Differences were considered signif icant when P was
目的观察祛痰化瘀利湿方对人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。方法将GSK-3β选择性小分子抑制剂作用于正常人滑膜细胞,以激活Wnt/β-catenin信号通路。提取并检测胞核蛋白β-catenin的表达,从而确定最佳激活时间点。将对数生长期的滑膜细胞分为正常组、SB-216763激活组、祛痰化瘀利湿方组,分别采取相应的干预措施。Western blot方法检测滑膜细胞胞核蛋白β-catenin及其下游基因Cyclin D1和MMP-7的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测滑膜细胞培养上清液中Cyclin D1和MMP-7的表达。结果成功激活正常人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,SB-216763干预后激活组胞核蛋白β-catenin及其下游基因Cyclin D1和MMP-7表达较正常组显著升高(P
精神分裂症断裂基因1(DISC1)是精神疾病的重要候选基因,是精神分裂症、双相情感障碍、抑郁症、自闭症和阿斯伯格综合征的一个共同的危险因素。许多遗传研究证实,DISC1不只是与精神分裂症有关,而且与各种伴有神经发育异常和细胞内的脑功能障碍信号通路有关。目前对DISC1在中枢神经系统作用的研究主要集中在神经元发生和神经元突触发育方面,如神经元的成熟、增殖、迁移、定位、分化,树突生长和突触可塑性等。DISC1编码DISC1蛋白,DISC1蛋白是一种多功能支架蛋白,它在成人大脑,尤其在海马齿状回的神经发生和神经发育方面具有重要的作用。DISC1有望成为精神疾病和癫的一个治疗靶点。本文就DISC1的生物学特性及主要相关信号通路作一综述。
目的:探究氯化锂(Lithium

{TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂| 购买TNF-alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂半抑制浓度|TNF-alpha抑制剂 价格|TNF-alpha抑制剂 花费|TNF-alpha抑制剂溶解度|TNF-alpha抑制剂购买|TNF-alpha抑制剂制造商|TNF-alpha抑制剂研究购买|TNF-alpha抑制剂订单|TNF-alpha抑制剂小白鼠|TNF-alpha抑制剂化学结构|TNF-alpha抑制剂分子量|TNF-alpha抑制剂分子重量|TNF-alpha抑制剂数据表|TNF-alpha抑制剂供应商|TNF-alpha抑制剂体外|TNF-alpha抑制剂细胞系|TNF-alpha抑制剂浓度|TNF-alpha抑制剂核磁共振|TNF-alpha抑制剂体内|TNF-alpha抑制剂临床试验|TNF-alpha抑制剂s|TNF-alpha signaling抑制剂|TNF-alpha pathway抑制剂|TNF-alpha signaling pathway抑制剂|TNF-alpha signaling抑制剂s|TNF alpha pathway抑制剂s|TNF-alpha signaling pathway抑制剂s|TNF-alpha抑制剂 library|TNF-alpha activity inhibition|TNF-alpha activity|TNF-alpha inhibition|TNF-alpha抑制剂s library|TNF alpha抑制剂 libraries|TNF-alpha抑制剂 screening library|TNF-alpha high throughput screening|TNF-alpha抑制剂s high throughput screening|TNF-alpha phosphorylation|TNF-alpha screening|TNF-alpha assay|TNF-alpha animal study| chlorid,LiCl)对人骨髓间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)迁移的影响。方法:采用划痕试验、Transwell chamber等方法,在梯度浓度LiCl作用下,观察对hMSCs迁移效果的影响并进行分析。结果:1划痕试验显示hMSCs在梯度浓度LiCl作用下,细胞迁移距离逐渐减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:LiCl可抑制hMSCs的迁移且呈浓度依赖性。
目的:观察补肾活血方对人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。方法:采用GSK-3β选择性抑制剂SB-216763作用于正常人滑膜细胞,然后提取和检测胞核蛋白β-catenin的表达,确定激活正常人滑膜细胞的Wnt/β-catenin信号通路的最佳时间点,然后给予补肾活血方含药血清干预,采用Western Blot检测人滑膜细胞胞核蛋白β-catenin及其下游基因MMP-7和Cyclin D1的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测滑膜细胞上清液中MMP-7和Cyclin 和 D1的表达。结果:Western Blot结果显示:成功激活正常人滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,与正常组比较,SB-216763干预组的人滑膜细胞核蛋白β-catenin、MMP-7和Cyclin D1的表达明显升高(P
目的探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)对巨噬细胞系RAW264.7活化的影响。方法将生长状态良好的RAW264.7细胞分为3组:实验对照组、脂多糖(LPS)组和GSK-3β特异抑制剂SB216763干预组,在12 h、24 h进行指标检测。采用Western印迹法检测细胞GSK-3β、p-GSK-3βser9蛋白的表达,ELISA试剂盒法检测细胞上清IL-10、TNF-α的变化,RT-PCR检测细胞中5-LO mRNA变化,免疫荧光法检测ED1表达,电镜下观察RAW264.7细胞形态变化。结果12 h和24 h LPS组与对照组相比,p-GSK-3βser9表达减少,GSK-3β表达不变,活性升高;TNF-α、IL-10及5-LO mRNA表达增多(P<0.