小鼠心脏内慢病毒转染采用心肌局部注射的方法,2X107 UT/30μL慢病毒或对照溶液分别选择3个不同的位置注入左心室壁中。继续喂养4周后将动物实施安乐死后取材。7.心脏功能检测用经胸超声心动图测量心脏功能,采用二维、M超、脉冲多普勒及组织多普勒超声成像技术检测心脏功能参数,评估心脏收缩舒张功能。8.心脏内皮细胞分离心脏单个细胞由组织单细胞分离器从心脏组织中分离出来,内皮细胞用包被CD146抗体的磁珠进行阳性分选,从而得到心脏内皮细胞。9.组织学分析心脏切片进行Masson染色和天狼猩红染色,并对心脏间质及血管周围的纤维化程度进行定量分析,以评估MEF2A干扰及高糖干预对纤维化的影响。10.免疫组织化学免疫组化分析心肌中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达情况。11.细胞荧光免疫和组织荧光免疫组化：细胞荧光免疫组化显示细胞内的MEF2A、CD31、VE-cadherin、FSP-1、α-SMA、
p38MAPK及Smad2的表达,组织荧光免疫组化显示心肌组织中CD31、S100A4和α-SMA的表达变化。12. 那个 SYBR Green实时荧光定量PCR分析SYBR Green RT-PCR分析心肌组织中MEF2A mRNA表达变化及心脏提取的内皮细胞中CD31, VE-cadherin, FSP-1和α-SMA等标记物mRNA表达变化。13.Western blot分析Western blot分析心脏组织及HUVECs细胞中MEF2A、CD31、VE-Cadherin S1004A/FSP-1、vimentin、α-SMA、p38MAPK、phospho-p38MAP、Smad2、 phospho-Smad2等的变化。14.统计分析所以数据用平均数±标准差表示,多组间比较用方差分析,p
研究背景及目的心肌纤维化可致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等严重疾病,预防和逆转心肌纤维化是临床治疗这类疾病的关键靶点之一。已有的研究表明,β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor,β-AR)的过度激活在心肌纤维化中发挥重要作用,但其病因及机制并不十分清楚。大量的临床研究报道,在扩张型心肌病、心力衰竭等多种心血管疾病患者血清中存在针对β1-肾上腺素受体细胞外第二环的自身抗体(autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenergic receptor,β1-AA),该抗体的阳性率和滴度均显著高于健康人群。随后的研究发现β1-AA具有类似儿茶酚胺物质的激动效应,可激活离体培养的心肌细胞上β1-肾上腺素受体(β1-adrenergic receptor,β1-AR)的下游信号且不容易脱敏,进而导致心肌细胞死亡、心功能下降。本课题组前期研究发现β1-AA长期存在时,可以导致心功能下降,而且在心衰模型中发现β1-AA与心肌纤维化密切相关。然而,β1-AA是否会直接导致心肌纤维化有待于进一步研究。由于心肌成纤维细胞的增殖和分泌是造成心肌纤维化的重要因素,本研究试图从动物水平观察β1-AA致心肌纤维化的特点,从细胞水平探讨β1-AA能否激活心肌成纤维细胞并导致其增殖和分泌功能改变,进而为相关心脏疾病的治疗提供实验依据。研究方法1.β1-AR单克隆抗体的制备根据人β1-肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECII,197aa-223aa,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A,人鼠同源性是100%)的氨基酸序列,合成纯度大于95%的两条抗原肽段(肽段一:HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC,肽段二:CHWWRAESDEARR)。利用合成的两条抗原肽段共同免疫小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术制备针对β1-AR-ECII的单克隆抗体。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium
哪里 VRT752271数据表 dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测该抗体的纯度,用链霉亲和素-酶联免疫吸附试验(Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay,SA-ELISA)检测β1-AR单克隆抗体与β1-AR的结合,用乳鼠心肌细胞跳动频率实验评价β1-AR单克隆抗体的功能。2.β1-AA被动免疫动物模型的建立选择6-8周龄健康雄性BALB/c小鼠,经SA-ELISA法检测血清β1-AA呈阴性的动物作为免疫对象,实验分为三组:1生理盐水溶剂对照组;2β1-AA组;3异丙肾上腺素阳性对照组。将β1-AR单克隆抗体按5μg/g体重剂量经腹腔注入小鼠,每2周免疫一次,共免疫16周;异丙肾上腺素按5μg/g经腹腔注入小鼠体内,每天一次,持续16周。采用心脏超声的方法动态检测各组小鼠的心功能;利用组织学检测方法HE染色分别观察小鼠心肌组织形态的改变及纤维化程度;利用Real
Time PCR技术检测胶原Ⅰ和胶原Ⅲ基因表达;利用Western Blot检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ蛋白表达水平。3.细胞实验采用差速贴壁法分离培养大鼠乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞;利用CCK-8试剂盒和CFSE染色法检测β1-AA对心肌成纤维细胞增殖的影响;利用细胞免疫荧光法、免疫沉淀法和小分子相互作用仪BLItz系统检测β1-AA与心肌成纤维细胞上β1-AR的直接结合;利用[125I]c AMP RIA KIT检测细胞内c AMP含量;Western blot分析β1-AR、PKA、P38MAPK、ERK1/2等蛋白的表达;AnnexinⅤ/PI双染法经流式检测细胞凋亡的情况;利用Fluo-3 AM钙离子探针检测细胞内钙离子水平;利用基因转染技术在工具细胞HEK293细胞上瞬时表达EGFP-β1-AR且在激光扫描共聚焦显微镜下观察β1-AA致β1-AR内吞的动态变化。研究结果1.随着β1-AA被动免疫小鼠时间的延长,小鼠的心脏功能逐渐下降,表现为:左心室射血分数下降、左心室短轴缩短率降低。并且在免疫16周时,β1-AA被动免疫小鼠心肌纤维化显著,表现胶原Ⅰ和胶原Ⅲ基因表达和蛋白表达显著增加。2.细胞实验结果显示,β1-AA可以促进心肌成纤维细胞的增殖,该增殖效应可被β1-AR细胞外第二环肽段完全阻断,被β1-AR阻断剂美托洛尔、PKA抑制剂H89和β2-AR阻断剂ICI118551部分阻断,提示β1-AR和β2-AR可能均是β1-AA致心肌成纤维细胞增殖的途径;β1-AA还可激活P38MAPK和ERK1/2信号,且P38MAPK阻断剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059均可阻断该增殖效应,提示P38MAPK和ERK1/2可能参与了β1-AA致心肌成纤维细胞增殖的信号;β1-AA刺激的心肌成纤维细胞的培养上清液促进了乳鼠心肌细胞的凋亡,提示β1-AA可以通过促进心肌成纤维细胞的分泌间接损伤心肌细胞。3.