免疫沉淀结果显示,给予insulin刺激时,S467A突变体不能被Akt磷酸化,并且不受Akt-Ser473被insulin磷酸化的影响。同样,用Akt inhibitor处理稳定表达Flag-TFEB或TFEB-S467A的细胞株时,TFEB-Ser467和Akt-Ser473的磷酸化都会受到抑制。另外,分别用过Wortmannin、Akt i不nhibitor和ERK抑制剂PD98059预处理细胞后给予insulin刺激,结果显示,Insulin可以显著增强TFEB-Ser467磷酸化,但在PI3K/Akt抑制剂处理的细胞中不能上调TFEB-Ser467磷酸化水平。体外激酶活性分析也证明突变体TFEB-S467A不能被Akt磷酸化。综上所述,TFEB被Akt磷购买MS-275酸化的位点是Ser467。小结1 Akt磷酸化TFEB。2 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点。第三部分Akt通过磷酸化TFEB而抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡目的探讨Akt信号通路抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的作用机制。方法1 Western blot检测SH-SHY5Y或神经元细胞被重组慢病毒TFEB、TFEBAZD3965体内-S467A以及TFEB-S467D感染后,过氧化氢、Akt抑制剂、EGF对PARP活化的影响。2流式细胞术检测SH-SHY5Y或神经元细胞被重组慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后,过氧化氢、Akt抑制剂、EGF对细胞凋亡的影响。3小鼠中脑注射重组腺病毒GFP、TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D后,免疫组化染色观察MPTP对小鼠中脑神经元凋亡的影响。