设计合成4组特异性针对PI3K基因的siRNA,构建shRNA质粒载体,感染Ishikawa细胞。2.利用RT-PCR和Western blot技术检测各组对目的基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的靶点。3.将选取的最佳靶点进行包装成慢病毒shRNA载体,感染Ishikawa细胞。4.将感染目的基因的细胞Ishikawa,经流式分选获得稳定的细胞株,采用RT-PCR和Western
CB-839 solubility dmso blot实验检测对目的基因的抑制效果。[结果]1.RT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰靶点,siRNA序列为：GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA2.经测序证实,运用特异性针对PI3K基因的siRNA,成功构建了慢病毒shRNA载体,包装滴度为8×108TU/ml。感染Ishikawa细胞,荧光倒置显微镜下观察及流式细胞仪检测,显示各组感染效率均在90%以上,病毒感染成功。3.经流式细胞仪分选后,RT-PCR和Western blot验证干扰效率,获得稳定转染的细胞株。[结论]RNA干扰技术可有效地抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因的表达,为后续实验奠定基础。第二部分 慢病毒介导的PI3K基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外影响[目的]利用RNA干扰技术抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因的表达,检测PI3K基因低表达后对雌二醇作用Ishikawa细胞后相关基因、蛋白的影响,观察对其存活能力、周期、凋亡影响,探究PI3K基因低表达后对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响及其潜在机制。[方法]1.RT-PCR和Western blot实验检测雌二醇作用感染前后Ishikawa细胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表达。2.MTT实验检测感染前后细胞的生长情况,分析PI3K基因沉默前后对Ishikawa细胞生存率的影响。3.细胞迁移实验Transwell检测感染前后细胞的体外迁移能力,分析PI3K基因沉默前后对Ishikawa细胞的体外迁移能力的影响。4.流式细胞仪检测经雌二醇处理后各组细胞周期及凋亡率的变化,分析PI3K基因沉默后对Ishikawa细胞周期及凋亡的影响。[结果]1.E2作用未转染的Ishikawa细胞后,细胞的VEGF、bFGF基因和蛋白较对照组明显增加(P0.05);
PI3K组细胞VEGF、bFGF基因和蛋白的表达较Ishikawa组相比明显减少,差别有统计学意义(p<0.05)2.MTT实验结果显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,细胞的倍增时间较对照组明显加快(P0.05); PI3K组细胞的倍增时间较Ishikawa组相比明显延长,差别有统计学意义(p<0.05)。3.迁移实验显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,穿过微孔的细胞数较对照组明显增加(P<0.05);PI3K组细胞穿过微孔的细胞个数比Ishikawa组明显减少,差别有统计学意义(p<0.05),表明PI3K低表达可以干扰E2上调子宫内膜癌细胞迁移的能力。4.细胞凋亡结果显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,比对照组总凋亡率(%)下降,差别有统计学意义(p0.05); 和 PI3K组细胞比Ishikawa组中晚期凋亡增加,总凋亡率(%)增加,差别有统计学意义(p0.05);PI3K组细胞与Ishikawa组相比,G0/G1期增加,S期和G2期减少,差别有统计学意义(p0.05);PI3K基因低表达的PI3K组移植瘤增长较Ishikawa组明显减慢,差异具有统计学意义。与Ishikawa组、NC组相比,PI3K组裸鼠移植瘤瘤体重量明显小于其它两组p0.05)。实验PI3K组移植瘤PI3K蛋白的表达量较Ishikawa组及NC组显著降低(P0.05),提示慢病毒介导的PI3K基因RNA干扰载体在体内仍能稳定遗传并高效表达。PI3K组p-Akt、VEGF、bFGF蛋白的表达量比Ishikawa组和NC组均显著降低(P<0.05)。[结论]PI3K基因低表达抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长,提示PI3K基因有可能成为子宫内膜癌的分子靶点。
目的：通过体外实验研究浒苔多糖粗提物对巨噬细胞株RAW264.7增殖，分泌细胞因子IL-6、TNF-α水平等细胞活性的变化，验证其调节免疫作用；并从浒苔多糖粗提物引起RAW264.7中mTOR
很少 mRAN表达变化来探讨可能的活化分子机理，为研究开发浒苔多糖提供依据。 方法： 1.细胞的复苏培养、传代、冻存和实验前处理。 2.检测不同剂量时间浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响：显微镜下观察细胞形态并成像；噻唑蓝（MTT）比色法检测增殖作用； 3.酶联免疫法（ELISA）检测不同剂量/时间浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子IL-6、TNF-α水平的影响； 4. Real Time PCR检测不同剂量/时间浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7mTOR基因表达相对定量变化的影响。 结果： 1.随干预剂量增加，镜下RAW264.7数量增多，体积变大细胞更多，分化愈明显；但随时间延长，RAW264.7数量减小，细胞体积变大。一定作用浓度下有随干预浓度增加相对细胞增殖率呈上升趋势；随时间延长各剂量组吸光度下降，其细胞增殖力减弱。 2.浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.7促进分泌细胞因子IL-6、TNF-α：在15.625-1000μg/mL范围内RAW264.7分泌IL-6作用呈剂量依赖性；低浓度范围（500μg/mL以下）RAW264.7分泌呈剂量依赖性，高浓度（1000μg/mL）RAW264.7分泌TNF-α作用减弱。 3. mTOR基因表达：浒苔多糖粗提物对RAW264.7巨噬细胞mTOR基因表达明显促进作用,有一定的剂量依赖性。 结论： 1.浒苔多糖在一定作用浓度范围、时间内有促进巨噬细胞RAW264.7增殖，初步证实其具有促进巨噬细胞增殖的活性，细胞增殖具有剂量依赖性,无细胞毒性,促进巨噬细胞增殖可能是浒苔多糖发挥免疫调节作用的方式之一。 2.浒苔多糖粗提物对巨噬细胞RAW264.